菌落的裂解及DNA結(jié)合于纖維素濾膜

（1） 在一張保鮮膜上制作一個(gè)裝有0.5mol/L NaOH的小洼（0.75ml），使菌落面朝上，將濾膜放到小洼上，展平保鮮膜，使濾膜均勻濕潤，讓濾膜留于原處2-3分鐘。

（2） 用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜，用一張新的保鮮膜和新配制的0.5mol/L NaOH重復(fù)步驟（1）。

（3） 吸干濾膜，將濾膜轉(zhuǎn)移到新的帶有1mol/L Tris·Cl(pH7.4）的保鮮膜洼上。5分鐘后吸干濾膜，再重復(fù)一次該步驟。

（4） 吸干濾膜，把它轉(zhuǎn)移到有1.5mol/L N***、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4）的保鮮膜小洼上5分鐘后吸干濾膜，轉(zhuǎn)移到一張干的濾紙上，植物染色體原位雜交檢測(cè)服務(wù)，置于室溫20-30分鐘，使濾膜干燥。

（5） 將濾膜夾在兩張干的濾紙之間，在真空烤箱中于80℃干烤2小時(shí)，固定DNA。

（6） 將固定在膜上的DNA與32 P標(biāo)記的RNA進(jìn)行雜交。

后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6），含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。

  原位雜交的預(yù)雜交：濕盒的準(zhǔn)備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預(yù)雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時(shí)。吸取多余液體，不洗。

   雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專1用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據(jù)雜交情況可以調(diào)節(jié))。

雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×***洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×***洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×***洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復(fù)0.2×***洗滌15分鐘×1-2次)。

        

首先，分子病理診斷為的診斷及鑒別診斷提供了依據(jù)，當(dāng)遇到少見疑難或罕見病例時(shí)，尤其是通過形態(tài)學(xué)和免yi組化染色仍不能確定的類型，這時(shí)候就需要借助分子病理技術(shù)，從***水平來判斷***的異常情況，協(xié)助病理醫(yī)生作出相對(duì)準(zhǔn)確的診斷并判斷該***的預(yù)后及轉(zhuǎn)歸。應(yīng)用領(lǐng)域廣泛的要數(shù)軟***和骨、淋巴造血系統(tǒng)，因?yàn)檫@些系統(tǒng)的相似而不同，單靠鏡下表現(xiàn)和已知的已無法滿足診斷需求。另外，分子病理檢測(cè)也常常運(yùn)用在分子分型中，比如大家熟知的分子分型，通過***表達(dá)譜研究，可將分為管腔A型、B型，HER-2陽性型，基底樣型。


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