點(diǎn)對點(diǎn)酵母雙雜交驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)流程

1、誘餌蛋白毒性及自激1活檢測；

2、共轉(zhuǎn)化：分別將誘餌/捕獲質(zhì)粒（pGBKT7-Bait/pGADT7-Prey）、陽性對照質(zhì)粒（pGBKT7-p53/pGADT7-T）、陰性對照質(zhì)粒（pGBKT7-Lam/pGADT7-T）分別共轉(zhuǎn)到Y(jié)2H Gold感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于DDO平板培養(yǎng)；

3、點(diǎn)板驗(yàn)證：分別從平板上挑單克1隆稀釋10倍、100倍、1000倍，然后點(diǎn)板到TDO/X/A和QDO/X/A固體培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證；

4、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與報告整理。

雜交結(jié)束后，去除雜交液，立即于室溫把濾膜放入大體積（300-500ml）的2×***和0.1% SDS溶液中，輕輕振搖5分鐘，并將濾膜至少翻轉(zhuǎn)一次。重復(fù)洗 一次，同時應(yīng)避免膜干涸。

68℃用300-500ml 1×***和0.1% SDS溶液洗膜兩次，每次1-1.5小時。此時已可進(jìn)行自顯影。如背景很高或?qū)嶒?yàn)要求嚴(yán)格的洗膜條件，可用300-500ml 0.2×***和0.1% SDS的溶液于68℃將濾膜浸泡60分鐘。

把濾膜放在紙巾上于室溫晾干后，染色體原位雜交技術(shù)服務(wù)公司，把濾膜（編號面朝上）放在一張保鮮膜上，并在保鮮膜上作幾個不對稱的標(biāo)記，以使濾膜與性自顯影片位置對應(yīng)。

用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X片并加上增感屏于-70℃***12-16小時。

底片顯影后，在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標(biāo)記陽性雜交信號的位置，同時在不對稱分布點(diǎn)的位置上作出標(biāo)記。可從底片上取下透明紙，通過對比紙上的點(diǎn)與瓊脂上的點(diǎn)來鑒定陽性菌落。

PCR技術(shù)是一種在生物體細(xì)胞外通過酶促合成特異DNA或DNA片段的方法。其原理是設(shè)計特異引物，在TaqDNA聚合酶催化作用下，經(jīng)過高溫變性、低溫退火和適溫延伸3個步驟反復(fù)循環(huán)，對某一特定模板的特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后應(yīng)用凝膠電泳或測序等方法分析產(chǎn)物。因此，該技術(shù)可以直接檢測******、細(xì)胞中是否存在某種病毒DNA，同時PCR技術(shù)還是***突變檢測的前期必備技術(shù)。


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