原位雜交天

1. 重新水化和固定

1） 吸取固定好的胚胎，加入50%的PBST溶液，放置5分鐘。

2） 置換成30%的PBST溶液，放置5分鐘

3） 置換成PBST溶液，放置5分鐘，重復一次

4） 置換成4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘5） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。

蛋白酶處理與后固定（本實驗不做此步）

1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節(jié)以下的胚胎不處理，5體節(jié)到24小時的胚胎處理3分鐘，24小時以上的胚胎處理5分鐘或者更長。發(fā)育時間越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶處理，發(fā)育時間長的胚胎就需要用蛋白酶來疏松***，分子病理技術服務，以便于雜交。

2） 用PBST溶液輕洗，在PBST中放置5分鐘。

3） 用4%多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，室溫。

4） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。

2. 預雜交

1）每個管中置換成大約300ulHYB－溶液，60℃水浴5分鐘，避免振蕩。

2）用等體積的HYB+取代HYB－。

3）60℃水浴，預雜交4小時以上。

3. 雜交

1）吸去預雜交的HYB+，加上100ul已加入探針的HYB+溶液（探針濃度約為1ng/ul）..

2）60℃ 溫浴過夜。注：雜交與預雜交的溫度可以是55到60度不等，溫度越低，探針結合越好，溫度越高，背景越小。

 滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗。

  .滴加生物素化鼠抗地1高辛：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。

滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。

滴加生物素化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。

DAB顯色：使用DAB顯色***盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現則可繼續(xù)顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。

.蘇1木素復染，充分水洗。

酒精脫水，二甲1苯透明，封片。

菌落的裂解及DNA結合于纖維素濾膜

（1） 在一張保鮮膜上制作一個裝有0.5mol/L NaOH的小洼（0.75ml），使菌落面朝上，將濾膜放到小洼上，展平保鮮膜，使濾膜均勻濕潤，讓濾膜留于原處2-3分鐘。

（2） 用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜，用一張新的保鮮膜和新配制的0.5mol/L NaOH重復步驟（1）。

（3） 吸干濾膜，將濾膜轉移到新的帶有1mol/L Tris·Cl(pH7.4）的保鮮膜洼上。5分鐘后吸干濾膜，再重復一次該步驟。

（4） 吸干濾膜，把它轉移到有1.5mol/L N***、0.5mol/L Tris·Cl (pH7.4）的保鮮膜小洼上5分鐘后吸干濾膜，轉移到一張干的濾紙上，置于室溫20-30分鐘，使濾膜干燥。

（5） 將濾膜夾在兩張干的濾紙之間，在真空烤箱中于80℃干烤2小時，固定DNA。

（6） 將固定在膜上的DNA與32 P標記的RNA進行雜交。

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