重組腺病毒-慢病毒構(gòu)建包裝服務(wù)
為促進國內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域的研究進展，RealGene從2008年開始，對國內(nèi)實驗室開展重組腺病毒/慢病毒構(gòu)建、包裝及擴增服務(wù)，可以由客戶提供自己的
基因，完成腺病毒/慢病毒構(gòu)建、鑒定、包裝的服務(wù)。
一、技術(shù)路線：
（一）A、腺病毒載體構(gòu)建：
本系統(tǒng)是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA為骨架，在克隆、包裝、擴增等各部條件做了改進和優(yōu)化，達到了克隆陽性率更高、質(zhì)量更可靠、
包裝穩(wěn)定、出毒迅速、滴度高等效果。在此基礎(chǔ)上，還拓展了更廣泛的應(yīng)用，可以提供各種帶報告基因的，帶不同標(biāo)簽的腺病毒構(gòu)建和包裝服務(wù)。
所包裝的腺病毒已成功應(yīng)用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因轉(zhuǎn)位，Co-IP，動物實驗，干細胞研究等科研實驗。并且可以完成較高難度的克隆構(gòu)建，包括具有
細胞毒性作用基因的腺病毒構(gòu)建，在短時間內(nèi)完成從原始質(zhì)粒到病毒DNA的構(gòu)建工作。 

• 克隆目的基因到穿梭載體（中介載體）及鑒定

根據(jù)客戶提供的原始質(zhì)粒信息確定克隆方案：

• 如果原始質(zhì)粒與本系統(tǒng)所用穿梭載體有匹配酶切位點，采用相應(yīng)的內(nèi)切酶切下相應(yīng)片斷，回收并連接到穿梭載體。酶切，測序鑒定；
• 如果原始質(zhì)粒與本系統(tǒng)所用穿梭載體沒有匹配酶切位點，設(shè)計帶有特殊接頭的引物進行PCR擴增，得到目的片斷，采用相應(yīng)的內(nèi)
  切酶切下相應(yīng)片斷，回收并連接到穿梭載體。酶切，測序鑒定；
• 對于不適用于以上方案或者有特定要求的樣品，與客戶協(xié)商定制具體實施方案

2）克隆目的基因到腺病毒載體pAdPL及鑒定
利用重組技術(shù)將目的片段的表達框從穿梭載體轉(zhuǎn)移到腺病毒載體。
酶切鑒定陽性克隆，將陽性克隆測序二次鑒定。
B、慢病毒載體構(gòu)建
慢病毒（Lent virus）載體是以HIV-1（人類免疫缺陷I型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體
上，達到持久性表達的效果?？捎行У馗腥旧窠?jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，效果非常理想，
因此具有廣闊的應(yīng)用前景。
（二）病毒包裝、擴增：

• 將鑒定正確的基因克隆到慢病毒載體，與輔助載體一起轉(zhuǎn)染293T細胞進行包裝；
• 將包裝好的病毒超速離心收集；
• 將濃縮病毒進行滴定，滴定結(jié)果單位為PFU/ml（一般為5×108 PFU/ml以上，體積為500μl以上，根據(jù)客戶需要，不同量有價格差異）

二、質(zhì)量控制與鑒定：

• 測序鑒定
• 根據(jù)特定引物作RT-PCR鑒定
• 蛋白表達鑒定（根據(jù)客戶要求并由客戶提供高特異性抗體）

三、客戶須知：
對于客戶所要構(gòu)建腺病毒的目的基因，客戶須提供詳細的基因相關(guān)信息，包括基因序列，載體序列，載體圖譜。
載體構(gòu)建步驟所需時間，根據(jù)不同構(gòu)建方案，需15到25個工作日。
從合同簽訂之日起，客戶需交納首期技術(shù)服務(wù)費（50%服務(wù)費），方可進行實驗。服務(wù)結(jié)束時一次結(jié)清余款。
客戶需提供的信息及材料：

• 插入目的片段序列信息，原始載體序列信息，載體圖譜，酶切分析圖等。
• 鑒定正確的原始質(zhì)粒，PCR引物及PCR鑒定方法說明（包括PCR體系及PCR條件）（非必需，或需協(xié)商），測序引物（非必需，或需協(xié)
  商）。
• 原始質(zhì)粒的酶切鑒定報告、測序報告，如果客戶確定基因的信息無誤，這條非必需。
• 實驗?zāi)康?、要求，目的基因有無細胞毒性，是否需要構(gòu)建對照病毒？
• 實驗要求包括：是否自行構(gòu)建腺病毒載體？是否要求更換啟動子、polyA等基因元件？
• 實驗?zāi)康陌ǎ河糜诩毎麑嶒炦€是動物實驗，需要感染的細胞類型或動物模型類型。

四、我們的承諾：

• 構(gòu)建腺病毒/慢病毒載體的時間約15到25個工作日。病毒的包裝，擴增的時間約20到30個工作日?？傆嬓枰?5-55個工作日。
• 提供重組穿梭載體或者siRNA載體，重組腺病毒載體的酶切及測序報告。
• 免費提供一管陰性對照（僅限通用型的，如果客戶指定的序列，需要另外計費）。
• 最大插入片段5kb－8Kb。

補充說明：

• 如果客戶需更換啟動子，需保證所插入的基因的表達產(chǎn)物對細胞無毒害作用，
• 如果插入的目的片段太長，客戶要求測序驗證全長，需要提供基因的特異引物，以測得全長，加收一定的費用。

五、腺病毒和慢病毒比較表 

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