小鼠精原gan細胞分離富集和培養(yǎng)

成年小鼠gao丸中約有108個細胞，其中約有 2×104個是精原gan細胞，僅占gao丸生精上皮細胞總數(shù)的 0.02～0.03%，精原gan細胞數(shù)量太少不利于體外培養(yǎng).分離和富集精原gan細胞成為精原gan細胞體外培養(yǎng)能否成功的前提條件.尋找分離和富集小鼠精原gan細胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠為實驗對象，先用0.25%胰酶1mM EDTA消化gao丸10min，用胎牛xue清終止消化，用一次40-um孔徑的濾器過慮制成單 細胞懸液，30%percoll不連續(xù)密度梯度法離心富集精原gan細胞，再根椐未分化精原gan細胞表面thy1.2(CD90.2)陽性CD117(c- kit)陰性特點用流式細胞儀將精原gan細胞分選出來，并在體外進行培養(yǎng)嘗試. 結(jié)果:30%percoll密度梯度離心前CD117(c-kit)陽性細胞占13.80±3.34%，CD90.2陽性細胞占28.98±4.51%， 二者都陽性細胞占8.98±2.98%，CD117陰性CD90.2陽性細胞占18.36±2.67%;離心后 CD117(c-kit)陽性細胞占12.37±3.34%，CD90.2陽性細胞占56.98±4.51%，細胞實驗外包，二者都陽性細胞占 8.20±3.98%，CD117陰性CD90.2陽性細胞占32.36±3.67%;CD117(c-kit)陽性細胞和二者都陽性細胞所占百分比前后 比較差異無顯著性(P>0.1)，安康細胞實驗，CD90.2陽性細胞和CD117陰性和CD90.2陽性細胞所占百分比前后比較差異有顯著性 (P<0.05);采用CD117和CD90.2作為標志分子，percoll離心后細胞懸液經(jīng)FACS分選后獲得細胞純度

平板克l隆形成實驗基本步驟::

1、取對數(shù)生長期的各組細胞，分別用0.25%胰 蛋白酶消化并吹打成單個細胞，并把細胞懸浮在10%胎牛的DMEM培養(yǎng)液中備用。

2、將細胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細胞分別以每皿50、100、200 個細胞的梯度密度分別接種含10mL 37預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動，細胞實驗外包選哪家，使細胞分散均勻。置37團5% CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3周。

3、經(jīng)常觀察，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定細胞5mL固定15分鐘。然后去固定液，加適量GIMSA應(yīng)用染色液染10~30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

4、將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)，或在顯微鏡(低倍鏡)計數(shù)大于10個細胞的數(shù)。后計算形成率。形成率= (數(shù)/接種細胞數(shù)) x100%平板形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關(guān)鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。平板形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關(guān)鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞- -定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。

細胞分化

細胞分化是指同一來源的細胞逐漸產(chǎn)生出形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征各不相同的細胞類群的過程，其結(jié)果是在空間上細胞產(chǎn)生差異，在時間上同一細胞與其從前的狀態(tài)有所不同。細胞分化的本質(zhì)是***組在時間和空間上的選擇性表達，通過不同***表達的開啟或關(guān)閉，終產(chǎn)生標志性蛋白質(zhì)。細胞誘導(dǎo)是指將一群不同類型或者形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征存在差異的細胞通過生物學(xué)、物理學(xué)等手段，將之轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂邢嗨?相同形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征的細胞群體的過程。