細胞ELISPOT檢測    

     1．培養(yǎng)板的預處理：在24孔培養(yǎng)板內加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用PBS洗滌3次，每次3min；

     2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過夜，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     3．制備細胞懸液：將待測已致敏小鼠處死，取出pi臟，***細胞，置于加有Hanks液的平皿內，用鈍頭直角9號zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細胞，用毛細吸管輕輕吹散細胞團后，成都細胞，將懸液通過250目尼龍網，取濾液，1000r/min離心5min，Hanks液洗滌3次，計數(shù)細胞后，用1640液重新懸浮細胞，配成所需濃度；

     4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度（104-106/ml）的細胞懸液，置37℃，5％CO2條件下孵育2-4h，棄掉培養(yǎng)液，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     6．加入辣根過氧化物酶結合的親合素（***i-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，動物細胞培養(yǎng)，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mlTMB溶液（4mg/ml  jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明膠溶液（用pH5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制）邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

     8．顯色與計數(shù)：將培養(yǎng)板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計數(shù)所顯示出的顏色的斑點。

二、脂質體轉染操作步驟

1、操作步驟 [方法一]：

(1) 細胞培養(yǎng)：取 6 孔培養(yǎng)板 (或用 35 mm 培養(yǎng)皿)，向每孔中加入 2 mL 含 1～2×105 個細胞培養(yǎng)液，37℃ CO2 培養(yǎng)至 40%～60% 匯合時 (匯合過分，轉染后不利篩選細胞)。

(2) 轉染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液 (為轉染每一個孔細胞所用的量)A 液：用不含培養(yǎng)基稀釋 1-10 μg DNA，終量 100μL，B 液：用不含培養(yǎng)基稀釋 2-50 μgLR，終量 100μL，輕輕混合 A、B 液，細胞融合實驗報告，室溫中置 10-15 分鐘，稍后會出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉染 (如出現(xiàn)沉淀可能因 LR 或 DNA 濃度過高所致，應酌情減量)。

(3) 轉染準備：用 2 mL 不含培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入 1 mL 不含培養(yǎng)液。

(4) 轉染：把 A/B 復合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37℃ 溫箱置 6～24 小時，吸除無轉染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

(5) 其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉染法相同。

注意：轉染時切勿加，對轉染效率有很大影響。

透射電鏡觀察:可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質固縮、邊.集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和調亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現(xiàn)象。

結果評判:調亡細胞體積變小，細胞質濃縮。調亡I期( pro-apoptosis nuclei)的細胞核內染色質高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象( c***itati)的空泡結構; IIa 期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生調亡小體。

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