RNA提取

1.棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗兩次1-2。

2.棄去PBS，用1000u1吸干凈殘余PBS。

3.加1ml TRIZOL研磨B 41。

4. 1.5mIEP管標(biāo)號(hào)與每孔相對(duì)應(yīng)備用。

5.研磨好的溶液轉(zhuǎn)移至對(duì)應(yīng)的 EP管中國(guó)。

6.往每個(gè)EP管中加入250ul，劇烈震蕩30s， 冰上靜置12min[問l。

7. 所有樣品4C離心，轉(zhuǎn)速: 13500轉(zhuǎn)1分鐘，云南pcr，時(shí)間: 15min.

8. 再次標(biāo)記一批同樣編號(hào)EP管。

9.離心后吸上清液400u1移入相應(yīng)編號(hào)的EP管中，再加入400ul異充

分混勻。4C冰箱35min。

10. 4C離心，轉(zhuǎn)速: 13500轉(zhuǎn)1分鐘，時(shí)間: 10min.

11.棄去.上清液，fish檢測(cè)，加1m175%乙醇，輕搖7]。

12. 4C離心，10600轉(zhuǎn)/分鐘，時(shí)間: 5min.

13. 棄上清液濾紙吸干。

14. 加DEPC水10ul溶解，-80C保存。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄前測(cè)濃度。

***RNA提取

1、剪米粒大小***塊放入EP管中標(biāo)號(hào)。

2、EP管中加300ul trizol浸泡30分鐘或更久。

3、用研磨棒研磨，以肉眼很難看到***為宜。

4、加700u1 trizol靜 置5分鐘。

二、操作步驟：

1. 所有在純化系統(tǒng)里使用的溶液當(dāng)日都需要經(jīng)過 0.22μm 的濾膜抽濾、脫氣處理；保存 4℃ 冰箱里的緩沖液若要在室溫使用需***至室溫后抽濾脫氣；

2. 樣品上柱純化前，需先濾膜過濾，實(shí)時(shí)熒光定量pcr，少量樣品可用離心（13000rpm，10min）；

3. 依次用水、緩沖液洗泵；設(shè)置流速和柱前警報(bào)壓（壓力值參閱層析柱及填料說明書，取較小的一個(gè)大耐受壓力）。防止柱中進(jìn)入氣泡，影響分離效果；

4. 當(dāng)柱子限壓在 0.3MPa，或者在限壓狀態(tài)下流速很低時(shí)，pH valve 中的 Restirtor 可以切換成 Off line，即顯示 By-pass 狀態(tài)；

5. 當(dāng)需要通過儀器上樣環(huán)上樣時(shí)，將 W1 閥口處換成帶透明短軟管的閥門，從此處閥門位通過倒吸樣品上樣；

6. 進(jìn)樣閥「Inject」為上樣狀態(tài)。上樣結(jié)束可將進(jìn)樣閥切換回「Load」?fàn)顟B(tài)。并用純水認(rèn)真清洗上樣環(huán)至少 3 次；將 W1 閥口處換回原來接頭閥門。

7. 純化結(jié)束后，用純水清洗泵和平衡柱子；再用 20% 的乙醇清洗泵以及系統(tǒng)。長(zhǎng)期不用，層析柱應(yīng)保存在 20% 的乙醇中，泵放置在 20% 乙醇中；

8. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后及時(shí)傾倒廢液瓶里的廢液；

16.長(zhǎng)鏈引物為什么出錯(cuò)的幾率非常高？

答：引物合成時(shí)，每一步反應(yīng)效率都不能達(dá)到100%，產(chǎn)生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長(zhǎng)，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴(kuò)增，不可能保證擴(kuò)增產(chǎn)物中沒有突變，引物合成也不可能保證100%正確。要知道，引物合成中發(fā)生錯(cuò)誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴(kuò)增過程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成，長(zhǎng)鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準(zhǔn)備。

17.如果測(cè)序發(fā)現(xiàn)突變，該如何處理？

答：遇到這種情況，首先和核酸合成廠家取得聯(lián)系，生產(chǎn)人員會(huì)檢查生產(chǎn)的原始記錄，熒光定量pcr，主要是核對(duì)合成序列是否和定單一致，他們?cè)陔娔X中一般會(huì)保留所有原始數(shù)據(jù)。在確認(rèn)引物合成序列沒有輸錯(cuò)的情況下，建議重新挑取測(cè)序，可能會(huì)找到正確的。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，40個(gè)堿基以下的引物，測(cè)1-2個(gè)就可以了；40個(gè)以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測(cè)一些了。一般情況下，每個(gè)突變的位點(diǎn)都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。也可以要求公司將引物免費(fèi)重合一次，不過重合的引物和次的引物一樣，都可能含突變，不會(huì)因?yàn)橹睾系囊锞蜏p少您的遇到問題的幾率。***拼接過程中，如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變點(diǎn)不多，就多測(cè)幾個(gè)，否則就重合一下引物。

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