3D細(xì)胞培養(yǎng)

3D多細(xì)胞腫liu球是在體外應(yīng)用***培養(yǎng)方法使腫liu細(xì)胞以多細(xì)胞集聚體的形式生長(zhǎng)成為具有三維結(jié)構(gòu)的球體。與傳統(tǒng)的2D貼壁細(xì)胞培養(yǎng)模型相比，3D多細(xì)胞腫liu球可以通過(guò)模擬三維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞與基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，從而更加貼近腫liu***中相應(yīng)的病理生理特征。因此， 3D多細(xì)胞腫liu球培養(yǎng)模型已經(jīng)逐漸應(yīng)用于gan細(xì)胞培養(yǎng)和分化、ai癥研究、yao物和毒性篩選及***工程等特定應(yīng)用中。雖然3D多細(xì)胞腫liu球模型具有更顯著的實(shí)體腫liu生理相關(guān)性，但是與2D貼壁細(xì)胞培養(yǎng)模型相比，獲得大量相對(duì)統(tǒng)一的3D多細(xì)胞腫liu球模型需要-系列的培養(yǎng)過(guò)程和表征手段。

Q:如何避免中沉淀物的出現(xiàn)？

A:首先要注意正確的解凍步驟，而且溶解過(guò)程中一定要每隔一段時(shí)間均勻而緩慢的搖動(dòng)。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在下列情況下沉淀物可能增加，使用中應(yīng)該盡量避免：

（1）熱滅活；

（2）在 37℃ 下培養(yǎng)；

（3）反復(fù)凍融；

（4）γ 射線照射；

（5）長(zhǎng)期儲(chǔ)存在 2-8℃；

（6）在室溫下放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)

Q:如何去除中的沉淀？

A:如想去除這些絮狀沉淀物，可以將分裝到無(wú)菌離心管中，以  400g  離心，上清液即可直接加入到培養(yǎng)基 內(nèi)一起過(guò)濾。

注意：不要以過(guò)濾的方式去除這些絮狀沉淀物，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包公司，因?yàn)檫@可能阻塞濾膜。

三、自噬過(guò)程進(jìn)行觀察和檢測(cè)

1、觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包選哪家，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為:新月?tīng)罨虮瓲?，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢(shì)。自噬體(***1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體(***2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo *** )

2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋 白來(lái)示蹤自噬形成由于電鏡耗時(shí)長(zhǎng)，涼山細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，不利于監(jiān)測(cè)(Monitoring) 自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過(guò)程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開(kāi)發(fā)出了此技術(shù)。無(wú)自噬時(shí)，GFP-LC3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時(shí)，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn) 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過(guò)計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)自噬活性的高低。

3、利用Western Blot檢測(cè)LC3-II/比值的變化以評(píng)價(jià)自噬形成自噬形成時(shí)，胞漿型LC3 (即 LC3-I)會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估計(jì)自噬水平的高低。(注意: LC3對(duì)LC3-II有更高的親和力，會(huì)造成假陽(yáng)性。方法2和3需結(jié)合使用，同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響。)

4、MDC (Monodansylcad***erine ，單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)外包，故屬于非特異性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。

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