大鼠脂肪的分離

 將***切取的大鼠脂肪***盡量剪碎后移至離心管，其余步驟與人脂肪的分離一致。

 經(jīng)***切除獲得的大鼠皮下脂肪***消化后原代培養(yǎng)24 h，且肉眼觀察會發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶底部貼附著一層網(wǎng)狀薄膜，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶可使這層網(wǎng)狀薄膜從瓶壁上脫落，鏡下觀 察發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞都附著于這層膜上，通過術(shù)獲取的人脂肪***消化后則無此現(xiàn)象。增加膠原酶的量和消化時間也無法避免，取材時的或脂肪間結(jié)締***未被完全消化，細(xì)胞，穿過細(xì)胞篩進(jìn)入了培養(yǎng)瓶并沉淀于瓶底部形成的。膠原蛋白酶雖然可以特異性水解膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞技術(shù)，但不會損傷其他蛋白質(zhì)。處理方法是37 ℃下用胰蛋白酶 消化5 min。然后利用40 μm的細(xì)胞篩過濾后傳代。 根據(jù)作者的經(jīng)驗，每毫升***切除的大鼠脂肪可分離基質(zhì)血管成分細(xì)胞約1.81×106個。原代培養(yǎng)2.24×10^7個大鼠基質(zhì)血管成分細(xì)胞，40 h后傳代時約剩余 6.2×10^6個細(xì)胞，細(xì)胞剩余率27%。

細(xì)胞實驗介紹——流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期：

細(xì)胞周期：指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。G0/G1期：有絲分裂發(fā)生，細(xì)胞分裂成兩個細(xì)胞，進(jìn)入下一個細(xì)胞周期，或者進(jìn)入靜止期（G0期），動物細(xì)胞培養(yǎng)，而G0期從DNA含量上無法與G1期區(qū)分，細(xì)胞開始RNA和蛋白質(zhì)的合成，但DNA含量仍保持二倍體。S期：DNA開始合成，細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量介于G1期和G2期之間。G2期和M期：當(dāng)DNA成為4倍體時，細(xì)胞進(jìn)入G2期。G2期細(xì)胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì)，細(xì)胞遷移實驗，直到進(jìn)入M期。

PI法是經(jīng)典的周期檢測方法。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與DNA的含量成正比例關(guān)系，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，就可以得到細(xì)胞周期各個階段的DNA分布狀態(tài)，從而計算出各個期的百分含量。

一般流程：細(xì)胞收集-70%酒精固定過夜-PI染色-流式細(xì)胞儀檢測。

細(xì)胞凋亡：細(xì)胞凋亡的早期就有細(xì)胞膜表面破損發(fā)生。破損時凋亡細(xì)胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細(xì)胞內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞的外膜。該過程發(fā)生在之前，檢測PS的表達(dá)，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對PS有很高的親和性，并且可以與暴露于細(xì)胞外的PS相結(jié)合。利用這一原理，可以將AnnexinV標(biāo)記熒光來識別早期的細(xì)胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)來區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞。PI的膜通透性很差，因而只能標(biāo)記壞死的細(xì)胞。

一般流程：細(xì)胞收集-PI-AnnexinV標(biāo)記-流式細(xì)胞儀檢測。

結(jié)果示例：

                                   圖 A 細(xì)胞周期檢測圖；B 細(xì)胞凋亡檢測圖

小鼠成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立

細(xì)胞之間的相互調(diào)控作用奠定基礎(chǔ).方法利用24 h內(nèi)新生小鼠顱骨和4~8周齡成年小鼠四肢長分別分離、培養(yǎng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，采用間接接觸的培養(yǎng)模式將接種了骨sui單核細(xì)胞的玻片或骨片置入提前24 h接種了成骨細(xì)胞的培養(yǎng)皿中進(jìn)行共培養(yǎng).共培養(yǎng)-定時間后進(jìn)行破 骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP染色鑒定和骨吸收功能檢測，并進(jìn)一 步采用RT- PCR對破骨細(xì)胞標(biāo)志酶***基質(zhì)金屬蛋白酶.9(MMP-9)、TRAP 和***蛋白酶K (Cathepsin K )的表達(dá)進(jìn)行檢測結(jié)果共培養(yǎng)5天后可觀TRAP(+)多核細(xì)胞形成13天TRAP(+ )多核細(xì)胞數(shù)目達(dá)到高峰;骨吸收陷窩在共培養(yǎng)7天后開始出現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，陷窩面積呈增加趨勢;破骨細(xì)胞標(biāo)志***TRAP在共培養(yǎng)3天時開始表達(dá)，而MMP-9和Cathepsin K則在共培養(yǎng)5天后表達(dá)結(jié)論共培養(yǎng)體系中成骨細(xì)胞對破骨細(xì)胞調(diào)控作用顯著誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞具有噬骨能力，該共培養(yǎng)模型可用于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的相互調(diào)控作用研究.

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