3D細胞培養(yǎng)

3D多細胞腫liu球是在體外應用***培養(yǎng)方法使腫liu細胞以多細胞集聚體的形式生長成為具有三維結(jié)構(gòu)的球體。與傳統(tǒng)的2D貼壁細胞培養(yǎng)模型相比，3D多細胞腫liu球可以通過模擬三維細胞網(wǎng)絡(luò)、細胞與基質(zhì)、細胞與細胞之間的相互作用，從而更加貼近腫liu***中相應的病理生理特征。因此， 3D多細胞腫liu球培養(yǎng)模型已經(jīng)逐漸應用于gan細胞培養(yǎng)和分化、ai癥研究、yao物和毒性篩選及***工程等特定應用中。雖然3D多細胞腫liu球模型具有更顯著的實體腫liu生理相關(guān)性，但是與2D貼壁細胞培養(yǎng)模型相比，獲得大量相對統(tǒng)一的3D多細胞腫liu球模型需要-系列的培養(yǎng)過程和表征手段。

Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）是一種基于WST-8的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的檢測***。WST-8【化學名：2-(2-甲氧ji-4-硝ji苯j(luò)i)-3-(4-硝ji苯j(luò)i)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，是一種類似于MTT的化合物，它在電子載體1-甲氧ji-5-甲ji吩嗪鎓***二jia酯（1-Methoxy PMS）存在的情況下，被線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙***甲瓚產(chǎn)物（formazan）。細胞增殖越多越快，顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺，對于同樣的細胞，顏色的深淺與活xi胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。

 細胞ELISPOT檢測    

     1．培養(yǎng)板的預處理：在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，單細胞測序技術(shù)，4h，棄掉板中的處理液，用PBS洗滌3次，每次3min；

     2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過夜，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     3．制備細胞懸液：將待測已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有Hanks液的平皿內(nèi)，用鈍頭直角9號zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細胞，浙江細胞，用毛細吸管輕輕吹散細胞團后，動物細胞培養(yǎng)，將懸液通過250目尼龍網(wǎng)，取濾液，1000r/min離心5min，Hanks液洗滌3次，細胞實驗室，計數(shù)細胞后，用1640液重新懸浮細胞，配成所需濃度；

     4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度（104-106/ml）的細胞懸液，置37℃，5％CO2條件下孵育2-4h，棄掉培養(yǎng)液，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     6．加入辣根過氧化物酶結(jié)合的親合素（***i-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mlTMB溶液（4mg/ml  jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明膠溶液（用pH5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制）邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

     8．顯色與計數(shù)：將培養(yǎng)板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計數(shù)所顯示出的顏色的斑點。

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