蛋白提取

大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液， 少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丁醇等有ji溶劑中，因些，可 采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。

(一)水溶液提取法

稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶 解，縮短提取時間。但另一方面. ，***檢測多少錢，溫度升高會使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基于這一點考慮提取蛋白質(zhì)和酶時一般采用低溫( 5度以下)操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解，可加入蛋白 水解酶抑zhi劑(如二yi丙基氟磷酸，碘yi酸等)。

分子實驗介紹——印跡（Western blot）檢測

通過SDS-PAGE凝膠將細(xì)胞或生物樣品內(nèi)的蛋白按照蛋白分子量從大到小規(guī)律分離開。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如纖維素薄膜或PVDF膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的起反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二起反應(yīng)（目前主要用HRP標(biāo)記的第二），經(jīng)過底物顯色或自顯影以檢測電泳分離的特異性目的***表達(dá)的蛋白成分（目前主要使用魯米諾和二抗中的HRP反應(yīng)發(fā)出熒光，pcr檢測，通過儀器或者膠片顯色）。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。

實驗流程：細(xì)胞收集-細(xì)胞裂解，蛋白提取-蛋白變性-SDS-PAGE電泳-蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜印記-蛋白封閉-目的孵育-二抗孵育-顯色拍照

結(jié)果示例：

圖 A不同大小的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，Western blot檢測圖片；B A蛋白不同培養(yǎng)時間后Western blot檢測圖片；C 使用Image pro plus軟件對A蛋白灰度檢測，A蛋白表達(dá)變化統(tǒng)計圖

通常活性氧陽性對照在刺激細(xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。

收集細(xì)胞后裝載探針：按照1：1000用無培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為一百萬至二千萬/毫升，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照及自己感興趣的刺激細(xì)胞，麗水pcr，或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞。通常活性氧陽性對照在刺激細(xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。

2.、檢測

對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計、熒光或流式細(xì)胞儀檢測。

對于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光或流式細(xì)胞儀檢測，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。