細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——慢病毒建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

慢病毒包裝：公司使用3質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)，慢病毒系統(tǒng)使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，過(guò)表達(dá)慢病毒系統(tǒng)使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三質(zhì)粒系統(tǒng)，將質(zhì)粒混勻后使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，培養(yǎng)48h后，收集上清。使用genecopo公司慢病毒顆粒純化***盒將慢病毒純化。純化后留取部分檢測(cè)病毒滴度，其余病毒凍存于-80℃冰箱中。

滴度檢測(cè)：將病毒顆粒使用梯度稀釋，分別293T細(xì)胞，72h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況。根據(jù)細(xì)胞熒光量計(jì)算病毒滴度。

細(xì)胞：在病毒前一天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，接種約10000個(gè)細(xì)胞于12孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜后使用無(wú)培養(yǎng)基稀釋病毒，加入12孔板中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行，病毒數(shù)量根據(jù)推薦細(xì)胞的MOI加入（若無(wú)推薦MOI，需做病毒梯度：1，5，10，50，100 5個(gè)梯度對(duì)細(xì)胞），細(xì)胞，6h后去除含病毒溶液，加入完全培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度。同時(shí)加入puromycin對(duì)細(xì)胞篩選，篩選約2周時(shí)間。細(xì)胞篩選好后，使用定量PCR和Western blot檢測(cè)目的***的穩(wěn)定表達(dá)情況。

實(shí)驗(yàn)流程：慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建-HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞-病毒收集-病毒純化-病毒滴度檢測(cè)-細(xì)胞-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選-穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞鑒定

結(jié)果示例：

                                               圖 A 病毒滴度檢測(cè)；B 目的細(xì)胞病毒效果圖

二、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作步驟

1、操作步驟 [方法一]：

(1) 細(xì)胞培養(yǎng)：取 6 孔培養(yǎng)板 (或用 35 mm 培養(yǎng)皿)，向每孔中加入 2 mL 含 1～2×105 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃ CO2 培養(yǎng)至 40%～60% 匯合時(shí) (匯合過(guò)分，轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞)。

(2) 轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液 (為轉(zhuǎn)染每一個(gè)孔細(xì)胞所用的量)A 液：用不含培養(yǎng)基稀釋 1-10 μg DNA，終量 100μL，細(xì)胞分化，B 液：用不含培養(yǎng)基稀釋 2-50 μgLR，終量 100μL，輕輕混合 A、B 液，室溫中置 10-15 分鐘，稍后會(huì)出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染 (如出現(xiàn)沉淀可能因 LR 或 DNA 濃度過(guò)高所致，應(yīng)酌情減量)。

(3) 轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用 2 mL 不含培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入 1 mL 不含培養(yǎng)液。

(4) 轉(zhuǎn)染：把 A/B 復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，搖勻，37℃ 溫箱置 6～24 小時(shí)，吸除無(wú)轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

(5) 其余處理如觀察、篩選、檢測(cè)等與其它轉(zhuǎn)染法相同。

注意：轉(zhuǎn)染時(shí)切勿加，對(duì)轉(zhuǎn)染效率有很大影響。

軟gu細(xì)胞培養(yǎng)

(1)豚鼠脫頸處死，備皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮膚。

(2)無(wú)菌操作下取下雙側(cè)股骨頭及膝關(guān)節(jié)(保留周圍肌肉，軟gu不能暴露)，75%酒精浸泡5分鐘，轉(zhuǎn)移至PBS緩沖液中，帶入超凈工作臺(tái)，剔除關(guān)節(jié)周圍附著的軟***，打開(kāi)髖、膝關(guān)節(jié)，用尖刀削取關(guān)節(jié)軟gu***，置入裝有PBS緩沖液的無(wú)菌培養(yǎng)皿，防止軟gu***被風(fēng)干。

(3)PBS緩沖液充分漂洗軟gu小塊3次，原代細(xì)胞，然后用小剪刀將軟gu塊切碎至約Imm3大小。

(4)再次用PBS緩沖液沖洗3次，濾干，將細(xì)小的軟gu塊置入放有0.2%的II型膠原酶3ml的廣口瓶里，搖勻后置于37°C恒溫震蕩箱中消化，40分鐘后將上層消化液轉(zhuǎn)移至15ml規(guī)格離心管中，800r/min離心5min，收集細(xì)胞(沉淀物)，加入含10%的胎牛xue清DMEM培養(yǎng)液4ml并吹打混勻，制成軟gu細(xì)胞混懸液。

(5)把消化所得的軟gu細(xì)胞混懸液收集于離心管中，經(jīng)濾網(wǎng)過(guò)濾后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并把細(xì)胞混懸液密度調(diào)整為2x105/ml接種于25cm2規(guī)格的培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)條件為37°C、5%CO2。

(6)未消化完的軟gu小塊繼續(xù)用II型膠原酶如_上法消化，直至軟gu塊基本消失。

(7)每日在倒置顯微鏡下觀察軟gu細(xì)胞生長(zhǎng)情況并拍照保存。

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