RNA pull down 檢測(cè)

RNA   pull down：RNA沉淀檢測(cè)，是檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實(shí)驗(yàn)方法之一。使用體外轉(zhuǎn)錄將RNA進(jìn)行生物素標(biāo)記，并與細(xì)胞蛋白裂解液孵育，形成RNA-蛋白復(fù)合物。復(fù)合物通過(guò)磁珠結(jié)合后分離，復(fù)合物純化洗脫后通過(guò)Western blot驗(yàn)證檢測(cè)特性的蛋白。若篩選可能結(jié)合的蛋白通過(guò)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)篩選。

RNA提取及注意事項(xiàng)

研究***的表達(dá)和調(diào)控時(shí)，需要從***或細(xì)胞中分離純化RNA。RNA質(zhì)量的高低經(jīng)常影響RT-PCR、cDNA庫(kù)構(gòu)建和Northern Blot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的成敗。

主要***

Trizol是一種新型總RNA抽提***，內(nèi)含異***胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，***細(xì)胞釋放出的核酸酶。

1.

Trizol***含有，具***性和刺激性，注重操作。

2.

RNase污染的主要來(lái)源是操作過(guò)程中手和空氣中的浮沉，注重配帶手套，樣品盡可能蓋嚴(yán)。

3. 細(xì)胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全會(huì)降低后得率，因?yàn)橐徊糠諶NA會(huì)殘留在未裂解的細(xì)胞中。細(xì)胞裂解之后要看不見(jiàn)顆粒狀物質(zhì)（結(jié)締***和骨除外）。在清洗和裂解細(xì)胞時(shí)在低溫下操作，防止在操作過(guò)程中釋放的內(nèi)源RNase降解了RNA。

4. 酵母和一些***由于細(xì)胞壁的特別結(jié)構(gòu)，可以加入Trizol***同時(shí)加入無(wú)RNase的玻璃珠并劇烈振蕩，dna檢測(cè)，使細(xì)胞裂解充分。

2-8℃ 避光保存一年。

注意事項(xiàng)

1. 為了避免蛋白質(zhì)變性，不要對(duì)樣品劇烈攪動(dòng)和反復(fù)凍融。

2. 緩沖溶液成分盡量模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)。。

3. 為了避免蛋白質(zhì)的氧化，將 0.1～1 mmol/LDTT（二硫蘇糖醇）(或 β-巰）加入到緩沖溶液中。

4. 為了避免***對(duì)目標(biāo)蛋白的***，將 1～10 mmol/LEDTA 金屬螯合劑加入。

5. 為了避免微生物生長(zhǎng)，紹興pcr，使用滅菌溶液。在純化任何一種蛋白質(zhì)的時(shí)候，***檢測(cè)多少錢，均必須時(shí)刻對(duì)它的穩(wěn)定性注意維護(hù)，使它的活性得到保護(hù)，需要牢記如下一些通用的注意事項(xiàng)。

6. 盡可能置于冰上或者在冷庫(kù)內(nèi)進(jìn)行操作。

7. 蛋白濃度不要太稀。

8. 除非是進(jìn)行聚焦層。否則 pH 需要合適，防止所使用的緩沖溶液 pH 與 pI 相同，使蛋白質(zhì)的沉淀得以避免。

9. 使用蛋白酶，避免蛋白酶對(duì)目標(biāo)蛋白的降解；在純化細(xì)胞中的蛋白質(zhì)時(shí)，將 DNA 酶加入來(lái)使得 DNA 降解，避免 DNA 對(duì)蛋白的污染。

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