線粒體測序

線粒體是真核生物的重要細(xì)胞器，是生物體的能量工廠，參與能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等許多生命活動(dòng)，對(duì)生物的生理活動(dòng)起著至關(guān)重要的作用。大部分線粒體***由于其母系遺傳特性以及進(jìn)化速率較快等特點(diǎn)，被廣泛地用于種群遺傳學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)、譜系地理學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、***診斷等學(xué)科領(lǐng)域。線粒體全***組在生物進(jìn)化的研究中具有的優(yōu)勢。由于線粒體有著與真核生物長期共生的進(jìn)化歷史，因此其***組包含了反映物種進(jìn)化的關(guān)鍵信息，同時(shí)，相對(duì)于核***組，線粒體***組小，容易對(duì)大量物種進(jìn)行橫向的比較分析，有利于生物進(jìn)化的研究，因而受到進(jìn)化生物學(xué)家的鐘愛。線粒體的組成可以從兩個(gè)層面上反映物種及群體的遺傳和進(jìn)化，即核酸序列組成和***組的結(jié)構(gòu)特征，兩者的特征具有不同的進(jìn)化機(jī)制和進(jìn)化速度，在進(jìn)化生物學(xué)研究中可以很好的互補(bǔ)。

microRNA芯片:

RNA干擾(RNA Interference， RNAi)現(xiàn)象是一種進(jìn)化上保守的抵御或外來病毒qin犯的防御機(jī)制。將含有靶***mRNA同源互補(bǔ)序列的RNA（Double strand RNA， dsRNA）導(dǎo)入細(xì)胞后，無錫pcr，能夠特異地識(shí)別該mRNA，引起mRNA的降解，從而導(dǎo)致相應(yīng)的功能缺失。RNAi提供了一種經(jīng)濟(jì)、快捷、gao效的***特異***表達(dá)的技術(shù)手段，該技術(shù)已被廣泛用于研究***功能和chuan染性***及惡xingzhong瘤***zhi療領(lǐng)域。目前常用的RNA干擾手段為miRNA、 shRNA和siRNA等。

MiRNA是一類可以通過RNAi機(jī)制調(diào)節(jié)***表達(dá)的內(nèi)源性小RNA，***檢測怎么做，人工miRNA與shRNA的設(shè)計(jì)原理基本相同，由于miRNA具有內(nèi)源性，因此其更易產(chǎn)生有效的***沉默。

技術(shù)流程：

dsRNA或pre-miRNA被導(dǎo)入細(xì)胞后，能夠被一種特異的核酸內(nèi)切酶（Dicer）識(shí)別并切割成為小片段，這些片段在RNA解旋酶的作用下解鏈。繼之反義鏈在與體內(nèi)一些酶（包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等）結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RNA-Induced Silencing Complex，RISC），RISC與mRNA同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，若miRNA與mRNA的結(jié)合位點(diǎn)配對(duì)，則切割mRNA；若miRNA與mRNA的結(jié)合位點(diǎn)不配對(duì)，則***mRNA的翻譯。

二、操作步驟：

1. 所有在純化系統(tǒng)里使用的溶液當(dāng)日都需要經(jīng)過 0.22μm 的濾膜抽濾、脫氣處理；保存 4℃ 冰箱里的緩沖液若要在室溫使用需***至室溫后抽濾脫氣；

2. 樣品上柱純化前，需先濾膜過濾，***檢測多少錢，少量樣品可用離心（13000rpm，10min）；

3. 依次用水、緩沖液洗泵；設(shè)置流速和柱前警報(bào)壓（壓力值參閱層析柱及填料說明書，取較小的一個(gè)大耐受壓力）。防止柱中進(jìn)入氣泡，影響分離效果；

4. 當(dāng)柱子限壓在 0.3MPa，實(shí)時(shí)熒光定量pcr，或者在限壓狀態(tài)下流速很低時(shí)，pH valve 中的 Restirtor 可以切換成 Off line，即顯示 By-pass 狀態(tài)；

5. 當(dāng)需要通過儀器上樣環(huán)上樣時(shí)，將 W1 閥口處換成帶透明短軟管的閥門，從此處閥門位通過倒吸樣品上樣；

6. 進(jìn)樣閥「Inject」為上樣狀態(tài)。上樣結(jié)束可將進(jìn)樣閥切換回「Load」?fàn)顟B(tài)。并用純水認(rèn)真清洗上樣環(huán)至少 3 次；將 W1 閥口處換回原來接頭閥門。

7. 純化結(jié)束后，用純水清洗泵和平衡柱子；再用 20% 的乙醇清洗泵以及系統(tǒng)。長期不用，層析柱應(yīng)保存在 20% 的乙醇中，泵放置在 20% 乙醇中；

8. 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后及時(shí)傾倒廢液瓶里的廢液；

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