分子實(shí)驗(yàn)介紹——熒光檢測(cè)

細(xì)胞熒光染色是以熒光物質(zhì)標(biāo)記而進(jìn)行抗原***的技術(shù)。在細(xì)胞中，通過特定的標(biāo)記，重慶pcr，可以檢測(cè)目的蛋白表達(dá)量和表達(dá)***。是細(xì)胞中的可直觀觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白***和表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方法。

實(shí)驗(yàn)流程：細(xì)胞固定-細(xì)胞膜破膜-蛋白封閉-目的蛋白結(jié)合-熒光二抗結(jié)合-DAPI染色-熒光顯微鏡拍照或激光共聚焦顯微鏡拍照。

結(jié)果示例：

細(xì)胞熒光染

通過觀察細(xì)胞中蛋白的熒光強(qiáng)度和***分析該蛋白的表達(dá)變化。

20.Primer設(shè)計(jì)的基本原則是什么？

答：引物設(shè)計(jì)的下列原則供您參考。

◆引物長(zhǎng)度一般在18-35mer。

◆G-C含量控制在40-60%左右。

◆避免近3"端有酶切位點(diǎn)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

◆如果可能避免在3"端5個(gè)堿基有2個(gè)以上的G或C。

◆如果可能避免在3"端1個(gè)堿基為A。

◆避免連續(xù)相同堿基的出現(xiàn)，特別是要避免GGGG或更多G出現(xiàn)。

◆退火溫度Tm控制在 58-60C 左右。

◆如果是設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物，突變點(diǎn)應(yīng)盡可能在引物的中間。

21.為什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？

答：引物應(yīng)該全是DNA，但是OD260/OD280的比值為什么那么低，怎么會(huì)有蛋白質(zhì)污染？引***學(xué)合成，哪里有機(jī)會(huì)污染到蛋白質(zhì)？需要指出的是OD260/OD280的比值不能用來衡量引物的純度。OD260/OD280的比值過低一般是由于引物中C/T 的含量比較高所致。下表是一個(gè)20mer 同聚體引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值與引物的堿基組成密切相關(guān)。

單細(xì)胞測(cè)序（英語：Single cell sequencing）采取優(yōu)化的下一代DNA測(cè)序技術(shù)（NGS）檢測(cè)單細(xì)胞的序列，可以獲得特定微環(huán)境下的細(xì)胞序列差異以方便研究其功能差異等。對(duì)個(gè)體細(xì)胞的DNA測(cè)序可以幫助我們了解例如在中的小范圍細(xì)胞的變異；對(duì)其進(jìn)行RNA測(cè)序可以幫助我們了解和鑒別不同的細(xì)胞類型與其表現(xiàn)的***，對(duì)研究發(fā)育生物學(xué)等有較大裨益。

分離單細(xì)胞

在全***組擴(kuò)增和測(cè)序前，有很多方法可以分離細(xì)胞個(gè)體，***檢測(cè)怎么做，其中流式細(xì)胞術(shù)（FACS）較為常用。個(gè)體細(xì)胞可以用顯微操作來收集，這樣較為快捷而且成本較低，但是比較有技術(shù)難度，而且顯微鏡下對(duì)細(xì)胞的錯(cuò)誤分類容易影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。激光捕獲顯微切割技術(shù)（LCM）亦可以用來收集單細(xì)胞。但是盡管激光捕獲顯微切割可以保留樣本細(xì)胞在***中的空間位置，PCR，但是捕獲單細(xì)胞的時(shí)候容易連帶周圍細(xì)胞的物質(zhì)。高通量的細(xì)胞個(gè)體分離還可以使用微流控技術(shù)。微流控技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)都能準(zhǔn)確而自動(dòng)地分離無偏樣本。但是，兩種方法都要求首先將細(xì)胞從其為環(huán)境中脫離，因此可能在RNA表達(dá)分析中造成對(duì)轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的干擾。