凍存袋技術(shù)
是將細(xì)胞放在低溫環(huán)境，減少細(xì)胞代謝，以便長期儲(chǔ)存的一種技術(shù)。細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一，起到了細(xì)胞保種的作用。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來，這樣在需要的時(shí)候再復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，200-074-401凍存袋代理，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到了細(xì)胞保種的作用。
凍存袋實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備
生長良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基、DMSO、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)、等速降溫機(jī)
冷凍方法理論準(zhǔn)備:
(1)傳統(tǒng)方法:冷存管置于4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-8O℃16~18小時(shí)(或隔夜)--->液氮槽長期儲(chǔ)存。-20℃不可超過1小時(shí)，以防止胞內(nèi)冰晶過大，造成細(xì)胞大量消失，亦可跳過此步驟直接放入-8O℃冰箱中。
(2）程序降溫:利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1~-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-8o℃以下) -120℃，再放在液氮槽長期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存。
細(xì)胞凍存步驟
1.用移液器吸走原培養(yǎng)基，加入適量PBS洗1-2遍;
2.加入適量胰酶，CS50凍存袋代理，置于培養(yǎng)箱中消化;
3.待消化到位后加入適量血漿或完全培養(yǎng)基終止消化，800-1000rpm離心3-5min;
4.配制凍存液，CS250凍存袋代理，待細(xì)胞離心后去上清，加入凍存液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106~1×107 cells/mL，凍存袋代理，轉(zhuǎn)移到凍存管中;
5.將凍存管放入程序降溫盒中，-80度過夜，然后轉(zhuǎn)移到液氮中保存。
6.凍存細(xì)胞后應(yīng)取出一管復(fù)蘇，檢測細(xì)胞的存活率。理論上細(xì)胞可在液氮內(nèi)長期保存，
為穩(wěn)妥起見可在細(xì)胞凍存半年后復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況，再繼續(xù)凍存
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