細(xì)胞凍存袋方法

1、消化細(xì)胞（同實(shí)驗(yàn)二），將細(xì)胞懸液收集至離心管中。

2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。

3、沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng)，計(jì)數(shù)，調(diào)整至5×106/ml左右。

4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。

5、將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴(yán)，否則復(fù)蘇時(shí)易出現(xiàn)爆裂。

6、貼上標(biāo)簽，CS250凍存袋批發(fā)，寫(xiě)明細(xì)胞種類(lèi)，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩。

7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘)→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱(－30℃ 1小時(shí)）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮。

注意：操作時(shí)應(yīng)小心，以免液氮。液氮定期檢查，CS50凍存袋批發(fā)，隨時(shí)補(bǔ)充，不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

細(xì)胞凍存復(fù)蘇方法

1.  細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)消毒，北京凍存袋批發(fā)，紫外照射40min以上。

2.  培養(yǎng)液（DMEM）、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱37°C預(yù)熱20min，備用。

3.  二亞砜（DMSO)在40°C冰箱中冷藏30min，備用。

4.  從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入400°C水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。

5.  將細(xì)胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養(yǎng)液，離心（1000r/min，5min）。

6.  用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，方培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

7.  記錄復(fù)蘇日期。

凍存袋注意事項(xiàng)

1.欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好且存活率高之狀態(tài)，約為80~90%致密度。

冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有antibody之產(chǎn)生。

2.細(xì)胞在液氮中可長(zhǎng)期凍存沒(méi)有時(shí)間限制，而不會(huì)影響細(xì)胞活力﹔在-70度可保存數(shù)月。注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。

DMSO應(yīng)為***級(jí)等級(jí)，無(wú)菌且無(wú)色是直接購(gòu)買(mǎi)無(wú)菌產(chǎn)品，以5~10m1小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。

3.凍存細(xì)胞數(shù)量要足夠。無(wú)論再怎么小心，細(xì)胞在冷凍和復(fù)蘇過(guò)程中總會(huì)死掉一批的。所以，一開(kāi)始凍存細(xì)胞的數(shù)量要足夠。一般要達(dá)到5× 10^6 /毫升，一瓶不夠兩瓶湊。但是，這個(gè)不能一概而論。有些細(xì)胞，比如雜交瘤細(xì)胞，只需要1-3x 10^6 /毫升

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